人白細胞介素6（IL-6）ELISA試劑盒

注意事項：

1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑。

2. 試劑盒未使用時應(yīng)保存在2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。

3. 試劑盒使用前請在室溫恢復 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。

4. 在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應(yīng)保持*。

5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。.

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶 蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹 打幾次。

7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的 試劑代替本試劑盒中的某單個組分。

8. 為保證結(jié)果準確，每次檢測均需做標準曲線。

安全提示： 試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試 劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物 實驗室安全防護有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。
 

試劑盒組成及儲存：

自備實驗器材（不提供，可代購）

1． 酶標儀（主波長450nm，參考波長 630nm）

2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

3． 洗板機或洗瓶

4． 37℃孵育箱

5． 雙蒸水，去離子水，量筒等 
 

人白細胞介素6（IL-6）ELISA試劑盒

樣本收集及儲存：

1. 細胞培養(yǎng)上清： 將細胞培養(yǎng)基移無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并 于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入

2-8℃儲存），避免反復凍融。

2. 血清樣本： 室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。

3. 血漿樣本： 將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混 合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。

※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高 于標準品的值，請將樣品做適當倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實驗前做預實驗以確定稀釋倍數(shù)。
 

人白細胞介素6

試劑準備：

1. 試劑回溫：先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入 37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。

2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋 成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。

3. 標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1ml凍干標準品中，靜置15分鐘待其*溶解后輕 輕混勻(濃度為2000pg/ml)，然后在其余七管中各加入500mL標準品/樣本稀釋液（SR1），按照以下濃度 進行2倍稀釋：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62 pg/ml進行稀釋。500pg/ml為標準曲線點 濃度，標準品/樣本稀釋液（SR1）作為標準曲線的零點（0pg/ml）。復溶過的標準品原液（2000pg/ml） 未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍 應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。

5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1 倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內(nèi)使用。

IL-6 Human ELISA Kit結(jié)果判斷：

1.用酶標儀 450 nm波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進行雙波長檢測，請 用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。

2.計算標準品、樣品的平均OD 值：每個標準品和標本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值

3.以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線，樣品中TNF-α含量可通過對應(yīng)OD 值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度。

4.若標本 OD 值高于標準曲線上限，應(yīng)做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù).
 

參數(shù)表征：

1. 數(shù)據(jù)及標準曲線

2. 靈敏度： 低可檢測人 TNF-α濃度達 8pg/ml， 20 個零標準品濃度 OD 的平均值加上兩個標準差，計算相應(yīng)的可檢測濃度。
3. 特異性： 不與人 TNF-β，GM-CSF，s TNFRI，s TNF RII 反應(yīng)，小鼠 TNF-α，s TNF RI
4. 重復性： 板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%。
5. 回收率： 在選取的健康人血漿、細胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的人 TNF-α，計算回收率。

6. 線性稀釋： 分別在選取的 4 份健康人血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人 TNF-α，在標準曲線動力學范圍內(nèi)進行稀 釋，評估線性.

參考文獻：

1. Hirano, T. et al. (1984) J. Immunol. 133:798.
2. Kikutani, H. et al. (1985) J. Immunol. 134:990.
3. Hirano, T. et al. (1986) Nature 324:73.
4. Haegeman, G. et al. (1986) Eur. J. Biochem. 159:625.
5. Van Snick, J. et al. (1988) Eur. J. Immunol. 18:193.
6. .Lotz, M. et al. (1988) J. Exp. Med. 167:1253.
7. Hirano, T. et al. (1990) Immunol. Today 11:443.
8. Hirano, T. et al. (1990) in Peptide Growth Factors and their Receptors I, Sporn, M.B.and A.B.Roberts eds., Springer-Verlag, New York, p. 663.
9. Kishimoto, T. et al. (1992) Science 258:5593.
10. Hirano, T. (1992) Clin. Immunol. Immunopathol. 62:S60.
 

常見問題及解決方法：

 參考文獻：
《iTRAQ‐Based Proteomic Analysis Exploring the Influence of Hypoxia on the Proteome of Dental Pulp Stem Cells under 3D Culture》 作者:Lei Dou  Qifang Yan  Panpan Liang  Pengfei Zhou  Yan Zhang  Ping Ji 期刊:Proteomics 影響因子:3.106 PMID:29327447
《Some cardiac marker levels and cytokines in diabetic patients》 作者:Esmail S. Kakey and Shahen S. Hussen 期刊:International Conference on Pure and Applied Sciences 影響因子: PMID:
《Effect of blood purification on serum miR-126 and VEGF levels in the process of atherosclerosis in uremic patients under maintenance hemodialysis》 作者:Dong Zhao,Hong Shao 期刊:The Kaohsiung Journal of Medical Sciences 影響因子:1.291 PMID:30041762
《Release of mitochondrial DNA correlates with peak inflammatory cytokines in patients with acute myocardial infarction.》 作者:Chaoyi Qin, Jun Gu, Ruiqi Liu, Fei Xu , Hong Qian, Qian He, Wei Meng 期刊:Anatol J Cardiol 影響因子:1.112 PMID:27721319