D-乳酸脫氫酶（D-LDH）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5285

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入0.8 mL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑分裝保存，-20℃可保存4周，避免反復(fù)凍融；

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：20 μmol/mL 酸鈉溶液。

產(chǎn)品說明：

乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是糖酵解途徑的末端酶，催化丙 酮酸與乳,苯 肼,酸之間的可逆反應(yīng)，伴隨著NAD⁺/NADH之間互變。根據(jù)其催化底物-乳酸構(gòu)型的不同，可分為D-乳酸脫氫酶（D-LDH，EC 1.1.1.28）與L-乳酸脫氫酶（L-LDH，EC 1.1.1.27）。

D-LDH催化NAD⁺氧化D-乳酸生成酸，酸進(jìn)一步與2,4-二硝* 肼作用生成酸二硝基 苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與酸濃度成正比。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3. 血清（漿）等其他液體：直接檢測。若有沉淀請離心后取上清待測。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至450nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋：將20μmol/mL酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水進(jìn)行稀釋得到2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3、 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋可參考下表：

備注：實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需10µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4、 在1.5mLEP管/96孔板按下表步驟加樣

充分混勻，室溫靜置3min，取200μL轉(zhuǎn)移至微量玻璃比色皿或96孔板中，450nm下測定吸光度，計(jì)算ΔA測定=A測定-A對照，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。空白管和標(biāo)準(zhǔn)曲線只需做1-2次，每個(gè)測定管需要設(shè)一個(gè)對照管。

三、D-LDH活性計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）帶入公式計(jì)算樣本濃度（x，μmol/mL）。

2. D-LDH活性計(jì)算

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol酸定義為一個(gè)酶活力單位。

D-LDH活性（U/mg prot）= x×V樣÷（Cpr×V樣）÷T×10³×F=66.67×x÷Cpr×F

(2) 按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol酸定義為一個(gè)酶活力單位。

D-LDH活性（U/g 質(zhì)量）= x×V樣÷（W÷V樣總×V樣）÷T×10³×F=66.67×x÷W×F

(3) 按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol酸定義為一個(gè)酶活力單位。

(4) D-LDH活性（U/10⁴ cell）= x×V樣÷（N÷V樣總×V樣）÷T×10³×F=66.67×x×F÷N

(5) 按血清（漿）等液體體積計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）等液體每分鐘催化產(chǎn)生1nmol酸定義為一個(gè)酶活力單位。

D-LDH活性（U/mL）=x×V樣÷V樣÷T×10³×F=66.67×x×F

V樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.01mL；V樣總：加入的提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量，以萬計(jì)；10³：單位換算系數(shù)，1μmol/mL=10³nmol/mL；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1. 如果測定管吸光值接近空白或ΔA測定過低，可適當(dāng)加大樣本量后重新測定；如果測定管吸光值超過1.5或ΔA測定超過0.4，建議將樣本用提取液適當(dāng)稀釋后進(jìn)行測定。注意同步修改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.109g兔腎加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用96孔板測得計(jì)算ΔA測定=A測定-A對照=0.425-0.298=0.127，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.5379x+0.0087，計(jì)算x=0.220，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

D-LDH活性（U/g 質(zhì)量）=66.67×x÷W×F =134.520 U/g 質(zhì)量

2、 取0.1018g擬南芥加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用96孔板測得計(jì)算ΔA測定=A測定-A對照=0.236-0.196=0.04，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.5379x+0.0087，計(jì)算x=0.058，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

D-LDH活性（U/g 質(zhì)量）=66.67×x÷W×F =38.109 U/g 質(zhì)量

3、 取500萬細(xì)胞加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用96孔板測得計(jì)算ΔA測定=A測定-A對照=0.225-0.174=0.051，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.5379x+0.0087，計(jì)算x=0.079，按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)目計(jì)算酶活得：

D-LDH活性（U/10⁴ cell）=0.133×x×F =0.010 U/10⁴ cell

4、 取10μL胎牛血清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計(jì)算ΔA測定=A測定-A對照=0.322-0.201=0.121，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.5379x+0.0087，計(jì)算x=0.209，按液體體積計(jì)算酶活得：

D-LDH活性（U/mL）=66.67×x×F =13.919 U/mL

參考文獻(xiàn)：

[1] Huang P H, Fu L C, Huang C S, et al. The uptake of oligogalacturonide and its effect on growth inhibition, lactate dehydrogenase activity and galactin-3 release of human cancer cells[J]. Food chemistry, 2012, 132(4): 1987-1995.

[2] Huang Y N, Xu G T, You C P. The research progress of the lactate dehydrogenases in lactic acid bacteria[J]. Science and Technology of Food Industry, 2016, (08): 369-373.

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