檸檬酸合酶
（CS）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
微量法
貨號(hào)：BC1065
規(guī)格：100T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑五：臨用前加入500 μL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存；

2. 試劑六：臨用前加入1.5 mL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存。

產(chǎn)品說(shuō)明：
CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，是三羧酸循環(huán)第一個(gè)限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點(diǎn)之一。
CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔*A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸；該反應(yīng)促使DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在412nm處有特征吸光值。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋、研缽/勻漿器、可調(diào)節(jié)移液器、微量玻璃比色皿/96孔板和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件

注意事項(xiàng)：
1、測(cè)定過(guò)程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失活。
2、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過(guò)程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。
3、最好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
4、用96孔板測(cè)定時(shí)，根據(jù)測(cè)定管數(shù)量配制測(cè)定管工作液（試劑三、四、五、六）和對(duì)照管工作液（試劑三、四），因通過(guò)單位時(shí)間內(nèi)吸光值變化計(jì)算酶活，不推薦同時(shí)測(cè)多個(gè)樣本。
5、推薦使用樣本蛋白濃度計(jì)算酶活，若用樣本質(zhì)量計(jì)算，則需加測(cè)胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。
6、附：使用樣本鮮重計(jì)算公式：
A、按微量玻璃比色皿計(jì)算
單位的定義：37℃或25℃下每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。
CS上清（U/g 質(zhì)量）=ΔA上清÷（ε×d）×V反總÷（W×V樣本÷V提取）÷T=1061×ΔA上清÷W
CS沉淀（U/g 質(zhì)量）=ΔA沉淀÷（ε×d）×V反總÷（W×V樣本÷V樣總）÷T=212×ΔA沉淀÷W
CS（U/g 質(zhì)量）=CS上清+CS沉淀=1061×ΔA上清÷W+212×ΔA沉淀÷W
ΔA上清：上清測(cè)定值；ΔA沉淀：沉淀測(cè)定值；ε：TNB的消光系數(shù)，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2 mL；d：比色皿光徑，1cm；V樣本：加入的樣本體積，0.007mL；V提取：提取液體積，1.01mL；V樣總：溶解沉淀的總體積，0.202mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；W：樣本質(zhì)量，g。
B、按96孔板計(jì)算
將上述公式中的d=1cm改為d=0.6cm（96孔板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g小鼠心臟樣本加入1mL提取液和10μL試劑二進(jìn)行勻漿研磨，取上清后再離心，取上清，取沉淀后加入200μL試劑一和2μL試劑二，之后按照測(cè)定步驟操作，用微量石英比色皿測(cè)吸光度后計(jì)算上清中：ΔA1=A2-A1 =1.4577-0.8015=0.6562，ΔA1’=A2’-A1’=0.7842-0.7331=0.0511，ΔA上清=ΔA1-ΔA1’=0.6051；沉淀中：ΔA1= A2 -A1 =0.4166-0.1303=0.2863，ΔA1’=A2’-A1’=0，ΔA沉淀=ΔA1-ΔA1’=0.2863，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：CS（U/g 質(zhì)量）= CS上清+CS沉淀=1061×ΔA上清÷W+212×ΔA沉淀÷W

= 1061×0.6051÷0.1+212×0.2863÷0.1=7027.067 U/g 質(zhì)量。
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

1. Ming Song,Fangfang Chen,Yihui Li,et al. Trimetazidine restores the positive adaptation to exercise training by mitigating statin-induced skeletal muscle injury. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. November 2017;(IF10.754)

2. Zhang J, Lv J, Xie J, et al. Nitrogen Source Affects the Composition of Metabolites in Pepper (Capsicum annuum L.) and Regulates the Synthesis of Capsaicinoids through the GOGAT–GS Pathway[J]. Foods, 2020, 9(2): 150.

參考文獻(xiàn)：
[1]  Agostinho F R, Réus G Z, Stringari R B, et al. Treatment with olanzapine, fluoxetine and olanzapine/fluoxetine alters citrate synthase activity in rat brain[J]. Neuroscience letters, 2011, 487(3): 278-281.
相關(guān)系列產(chǎn)品：
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