植物類胡蘿卜素含量檢測試劑盒說明書

微量法

貨號: BC4335

規(guī)格: 100T/96S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

提取液：自備80%丙 酮，將丙 酮：蒸餾水（V:V）=4:1混合待用，提供一個125mL空瓶。

產品簡介：

類胡蘿卜素(carotenoid)是一類重要的天然色素的總稱，普遍存在于動物、高等植物、真菌、藻類的黃色、橙紅色或紅色的色素之中。類胡蘿卜素是體內維生素A的前體，同時還具有抗氧化、免疫調節(jié)、抗癌、減輕心血管疾病及著色劑等作用。

植物的類胡蘿卜素存在于各種黃色質體或有色質體內；如黃葉，黃色花卉，黃色和紅色的果實和黃色塊根等組織，樣本通過溶劑萃取，分離提取類胡蘿卜素，在440±10nm處有特殊吸收峰。

大部分高等植物和藻類微生物的葉綠體內也含有類胡蘿卜素，類胡蘿卜素主要吸收藍紫光，而葉綠素a和葉綠素b既吸收紅光又可吸收藍紫光。所以針對含葉綠體的組織，為排除葉綠素a和葉綠素b對類胡蘿卜素的干擾，根據經驗公式先計算出葉綠素a和葉綠素b的含量，再進一步得出類胡蘿卜素的含量；針對不含葉綠素的組織可以直接根據類胡蘿卜素的經驗消光系數(shù)進行計算。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、微量玻璃比色皿/96孔板（非聚苯乙烯材質）、天平、可調式移液槍、研缽/勻漿器、10 mL離心管/試管、蒸餾水和丙 酮。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、新鮮植物葉片（去掉中脈）或其他組織用蒸餾水洗干凈，然后吸干表面水分，稱取約0.1g，剪碎放入研缽或勻漿器中。

2、加入1mL蒸餾水，少量試劑一（約10mg），在黑暗或弱光條件下充分研磨，轉入10mL離心管或試管中。

3、用提取液沖洗研缽或勻漿器，將所有沖洗液轉入10mL離心管或試管中，用提取液定容至10mL，置于黑暗條件或者包上錫箔紙浸提3h（期間可以顛倒混合2次），觀察底部組織殘渣接近于白色則提取全，若組織殘渣未全變白，繼續(xù)浸提至組織殘渣顏色接近于白色。

二、測定步驟

A、黃色或其他非綠色組織（不含葉綠體）類胡蘿卜素含量測定步驟：

1、分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至440nm，分光光度計用提取液調零。

2、樣本檢測（微量玻璃比色皿檢測不用測空白管，用96孔板檢測空白管只需檢測1-2次）

B、新鮮植物葉片或其他綠色組織（含葉綠體）類胡蘿卜素含量測定步驟：

1、 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)多波長至470nm、646nm和663nm，分光光度計用提取液調零。

2、 樣本檢測（微量玻璃比色皿檢測不用測空白管，用96孔板檢測空白管只需檢測1-2次）

注意：若上層浸提液有殘渣，可吸取1mL上層浸提液置于1.5mL棕色EP管，常溫下4000r/min離心5min，再取上清液檢測；若使用聚苯乙烯材質的96孔板，請在加樣后5min內盡快測定完成。

三、類胡蘿卜素含量的計算

A、黃色或其他非綠色組織（不含葉綠體）類胡蘿卜素含量的計算公式：

1、按微量玻璃比色皿計算

類胡蘿卜素含量（mg/g 質量）=A₄₄₀÷（ε×d）×V 樣總×1000÷W×F=0.04×A₄₄₀×F÷W

V 樣總：提取液總體積，0.01L；1000：單位換算系數(shù)，1g=1000mg；ε：類胡蘿卜素經驗消光系數(shù)，250L/g/cm；d：比色皿光徑，1cm；F：稀釋倍數(shù)；W：樣本質量，g。

2、按96孔板計算

類胡蘿卜素含量（mg/g 質量）=ΔA₄₄₀÷（ε×d）×V 樣總×1000÷W×F=0.067×ΔA₄₄₀×F÷W

V 樣總：提取液總體積，0.01L；1000：單位換算系數(shù)，1g=1000mg；ε：類胡蘿卜素經驗消光系數(shù)，250L/g/cm；d：96孔板光徑，0.6cm；F：稀釋倍數(shù)；W：樣本質量，g。

B、新鮮植物葉片或其他綠色組織（含葉綠體）類胡蘿卜素含量的計算公式：

1、按微量玻璃比色皿計算

C_a（mg/L）=12.21×A₆₆₃-2.81×A₆₄₆

C_b（mg/L）=20.13×A₆₄₆-5.03×A₆₆₃

類胡蘿卜素濃度：C_c（mg/L）=（1000×A₄₇₀-3.27×C_a-104×C_b）÷229=4.367×A₄₇₀-0.014×C_a-0.454×C_b

類胡蘿卜素含量（mg/g 質量）=C_c×V提取×F÷W=0.01×C_c×F÷W

V提取：提取液體積，0.01L；F：稀釋倍數(shù)；W：樣本質量，g。

2、按96孔板計算：

C_a（mg/L）=（12.21×ΔA₆₆₃-2.81×ΔA₆₄₆）÷0.6 =20.35×ΔA₆₆₃-4.83×ΔA₆₄₆

C_b（mg/L）=（20.13×ΔA₆₄₆-5.03×ΔA₆₆₃）÷0.6 =33.55×ΔA₆₄₆-8.38×ΔA₆₆₃

類胡蘿卜素濃度：C_c（mg/L）=（1000×ΔA₄₇₀÷0.6-3.27×C_a-104×C_b）÷229=7.278×ΔA₄₇₀-0.014×C_a-0.454×C_b

類胡蘿卜素含量（mg/g 質量）=C_c×V提取×F÷W =0.01×C_c×F÷W

V提取：提取液體積，0.01L；F：稀釋倍數(shù)；W：樣本質量，g；0.6：光徑比例，0.6cm（96孔板光徑）：1cm（比色皿光徑）。

注意事項：

1. 若不確定組織中有無葉綠素影響，可取樣本提取液采用分光光度計在波長400-700nm下進行掃描，看波長640-670nm之間有無波峰，有波峰則為有葉綠素，反之則無。

2. 若使用聚苯乙烯材質的96孔板，請在加樣后5min內盡快測定完成。

3. 當A超過1時，建議將樣本用提取液稀釋后再進行測定，計算公式中乘以稀釋倍數(shù)F。

4. 為了避免色素見光分解，操作時應盡量避光，研磨或勻漿時應盡量縮短時間。

5. 提取液易揮發(fā)，操作時做好防護措施。

實驗實例：

1. 取0.1g黃色花朵加入1mL蒸餾水、少量試劑一（約10mg），在黑暗或弱光條件下充分研磨，轉入10mL離心管，提取液沖洗研缽或勻漿器，用提取液定容至10mL，置于黑暗條件或者包上錫箔紙浸提3h（期間可以顛倒混合2次），按照操作步驟A，用96孔板測定并計算ΔA₄₄₀=A₄₄₀測定管-A₄₄₀空白管=0.202-0.045=0.157，計算含量得：

類胡蘿卜素含量（mg/g 質量）=0.067×A₄₄₀÷W=0.1052 mg/g 質量。 

2. 取0.1g綠蘿葉片加入1mL蒸餾水、少量試劑一（約10 mg），在黑暗或弱光條件下充分研磨，轉入10 mL離心管，提取液沖洗研缽或勻漿器，用提取液定容至10 mL，置于黑暗條件或者包上錫箔紙浸提3 h（期間可以顛倒混合2次），按照操作步驟B，用96孔板測定并計算ΔA₄₇₀=A₄₇₀測定管-A₄₇₀空白管=0.415-0.043=0.372、ΔA₆₄₆=A₆₄₆測定管-A₆₄₆空白管=0.189-0.042=0.147、ΔA₆₆₃=A₆₆₃測定管-A₆₆₃空白管=0.379-0.042=0.337。計算含量得：

C_a（mg/L）=20.35×0.337-4.83×0.147=6.145 mg/L；

C_b（mg/L）=33.55×0.147-8.38×0.337=2.108 mg/L；

C_c（mg/L）=7.278×ΔA₄₇₀-0.014×C_a-0.454×C_b=1.662 mg/L；計算含量得：

類胡蘿卜素含量（mg/g 質量）=0.01×C_c×F÷W =0.1662 mg/g 質量。

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