ATP-檸檬酸裂解酶（ACL）活性檢測(cè)試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號(hào)：BC4245

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 提取液二：為易揮發(fā)試劑，用完后盡快密封，-20℃保存；

2、 試劑二：臨用前取1支加入0.5mL試劑一，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

3、 試劑三：臨用前取1瓶加入2.25 mL試劑一，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

4、 試劑四：臨用前取1支加入0.5 mL試劑一，充分溶解；用不完的試劑可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

5、 試劑五：使用前請(qǐng)先離心再用移液槍吹打混勻。取3 μL試劑五加1000 μL蒸餾水充分混合（約100T），現(xiàn)用現(xiàn)配，也可根據(jù)樣本量按比例配制；

6、 提取液的配制：按提取液一︰提取液二=990︰10（V︰V）的比例配制，根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，禁止將提取液二一次性全部加入提取液一混勻分裝待用。

產(chǎn)品說明：

ATP-檸檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase，ACL）是催化檸檬酸生成乙酰輔*A的關(guān)鍵胞質(zhì)酶，其催化產(chǎn)生的乙酰輔*A是合成脂肪酸與膽*醇等脂類物質(zhì)的主要原料，并可參與相關(guān)重要蛋白的修飾作用，是體內(nèi)能源物質(zhì)代謝的樞紐性物質(zhì)。在ATP和輔*A存在的情況下，ACL能將檸檬酸催化裂解為乙酰輔*A、草酰乙酸、ADP和磷酸鹽，蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD⁺，導(dǎo)致340nm處光吸收下降。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、天平、臺(tái)式低溫離心機(jī)、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、冰、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照質(zhì)量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。于4℃，8000g離心10min，取上清，置于冰上待測(cè)。

2、細(xì)胞或細(xì)菌：按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量（10⁴個(gè)）︰提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌（功率300W，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min），于4℃，8000g離心10min，取上清，置于冰上待測(cè)。

3、血清（漿）或其他液體：直接檢測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將試劑一置于37℃水浴10min。

3、 操作表 (在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入下列試劑) ：

注意：如果樣本量大，可按試劑一︰試劑二︰試劑三︰試劑四︰試劑五=152︰4︰20︰4︰10的比例配制成工作液使用，工作液應(yīng)根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用。

三、ACL活性計(jì)算

A、按微量石英比色皿計(jì)算：

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位

ACL活性（U/mg prot）=[ΔA×V反總×10⁹÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) ÷T=1607.7×ΔA÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

ACL活性（U/g 質(zhì)量）=[ΔA×V反總×10⁹÷（ε×d）]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1607.7×ΔA÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

單位定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

ACL活性（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反總×10⁹÷（ε×d）] ÷(N×V樣÷V樣總) ÷T=1607.7×ΔA÷N

4. 按液體體積計(jì)算

單位定義：每mL液體每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

ACL（U/mL）=[ΔA×V反總×10⁹÷（ε×d）]÷V 樣÷T=1607.7×ΔA

V反總：反應(yīng)總體積，2×10^-4L；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量，以萬(wàn)計(jì)；T：反應(yīng)時(shí)間，2min。

B、按照96孔UV板計(jì)算

5. 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位

ACL活性（U/mg prot）=[ΔA×V反總×10⁹÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) ÷T=2679.5×ΔA÷Cpr

6. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

ACL活性（U/g 質(zhì)量）=[ΔA×V反總×10⁹÷（ε×d）]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=2679.5×ΔA÷W

7. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

單位定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

ACL活性（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反總×10⁹÷（ε×d）] ÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=5.359×ΔA

8. 按液體體積計(jì)算

單位定義：每mL液體每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

ACL（U/mL）=[ΔA×V反總×10⁹÷（ε×d）]÷V 樣÷T=2679.5×ΔA

V反總：反應(yīng)總體積，2×10^-4L；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，0.6cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量，500萬(wàn)，T：反應(yīng)時(shí)間，2min。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g黑麥草，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，于4℃，8000g離心10min，取上清，按照測(cè)定步驟操作，用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管= A1測(cè)定-A2測(cè)定=1.7569-1.7034=0.0535，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.459-0.457=0.002，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.0535-0.002=0.0515，按樣本質(zhì)量計(jì)算得：ACL活性（U/g 質(zhì)量）=1607.7×ΔA÷W=827.9655 U/g 質(zhì)量。

2. 取0.1g肝臟組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，于4℃，8000g離心10min，取上清，按照測(cè)定步驟操作，用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管= A1測(cè)定-A2測(cè)定=1.2341-1.0503=0.1838，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.459-0.457=0.002，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.1838-0.002=0.1818，按樣本質(zhì)量計(jì)算得：

ACL活性（U/g 質(zhì)量）=1607.7×ΔA÷W=2922.7986 U/g 質(zhì)量。

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