ATP-檸檬酸裂解酶（ACL）活性檢測試劑盒說明書

紫外分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC4240

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 提取液二：為易揮發(fā)試劑，用完后盡快密封，-20℃保存；

2、 試劑二：臨用前加入1.3 mL試劑一溶解；用不完的試劑可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

3、 試劑三：臨用前加入6 mL試劑一溶解；用不完的試劑可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

4、 試劑四：臨用前加入1 mL試劑一溶解；用不完的試劑可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

5、 試劑五：臨用前加入0.5mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

6、 試劑五工作液：根據(jù)樣本量按照試劑五：蒸餾水=0.025mL：0.8mL（共0.825mL，約16T）的比例進(jìn)行配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，當(dāng)天用完；

7、 提取液的配制：按提取液一︰提取液二=990︰10（V︰V）的比例配制，根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，禁止將提取液二一次性全部加入提取液一混勻分裝待用。

產(chǎn)品說明：

ATP-檸檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase，ACL）是催化檸檬酸生成乙酰*酶A的關(guān)鍵胞質(zhì)酶，其催化產(chǎn)生的乙酰*酶A是合成脂肪酸與膽*醇等脂類物質(zhì)的主要原料，并可參與相關(guān)重要蛋白的修飾作用，是體內(nèi)能源物質(zhì)代謝的樞紐性物質(zhì)。

在ATP和*酶A存在的情況下，ACL能將檸檬酸催化裂解為乙酰*酶A、草酰乙酸、ADP和磷酸鹽，蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD⁺，導(dǎo)致340nm處光吸收下降。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、天平、臺式低溫離心機、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、冰、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照質(zhì)量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。于4℃，8000g離心10min，取上清，置于冰上待測。

2、細(xì)胞或細(xì)菌：按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量（10⁴個）︰提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌（功率300W，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min），于4℃，8000g離心10min，取上清，置于冰上待測。

3、血清（漿）或其他液體：直接檢測。

二、測定步驟

1、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將試劑一置于37℃水浴10min。

3、 操作表 (在1mL石英比色皿中依次加入下列試劑) ：

注意：如果樣本量大，可按試劑一︰試劑二︰試劑三︰試劑四︰試劑五工作液=760︰20︰100︰20︰50的比例配制成工作液使用，工作液應(yīng)根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用。

三、ACL活性計算

1. 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位

ACL活性（U/mg prot）=[ΔA×V反總×10⁹÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) ÷T=1607.7×ΔA÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

ACL活性（U/g 質(zhì)量）=[ΔA×V反總×10⁹÷（ε×d）]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1607.7×ΔA÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計算

單位定義：每1萬個細(xì)胞或細(xì)菌每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

ACL活性（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反總×10⁹÷（ε×d）] ÷(N×V樣÷V樣總) ÷T=1607.7×ΔA÷N

4. 按液體體積計算

單位定義：每mL液體每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

ACL（U/mL）=[ΔA×V反總×10⁹÷（ε×d）]÷V 樣÷T=1607.7×ΔA

V反總：反應(yīng)總體積，1×10^-3 L；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量，以萬計；T：反應(yīng)時間，2min。

實驗實例：

1. 取0.1g黑麥草，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，于4℃，8000g離心10min，取上清，按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管= A1測定-A2測定=1.549-1.512=0.037，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.411-0.41=0.001，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.037-0.001=0.036，按樣本質(zhì)量計算得：

ACL活性（U/g 質(zhì)量）=1607.7×ΔA÷W=578.772 U/g 質(zhì)量。

2. 取0.1g肝臟組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，于4℃，8000g離心10min，取上清，按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管= A1測定-A2測定=1.165-0.985=0.179，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.411-0.41=0.001，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.179-0.001=0.178，按樣本質(zhì)量計算得：

ACL活性（U/g 質(zhì)量）=1607.7×ΔA÷W=2861.706 U/g 質(zhì)量。

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