磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC2195

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑四：臨用前加入2 mL蒸餾水充分溶解待用；可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融；

2、 試劑五：臨用前加入2 mL蒸餾水充分溶解待用；可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融；

3、 試劑六：臨用前加入250μL 試劑六溶解液溶解；可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融；

4、 試劑七：臨用前加入5.26 mL蒸餾水，可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融；

5、 工作液的配制：根據(jù)樣本數(shù)量按體積比試劑二：試劑三：試劑四：試劑五：試劑六：試劑六溶解液：試劑七=270μL：270μL：270μL：270μL：35μL：325μL：360μL（共1.8mL，20T）的比例混合。工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（EC 4.1.1.31）廣泛存在于植物和微生物中，在動物及絲狀霉菌中缺乏此酶。是催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化碳反應生成草酰乙酸呈不可逆反應的酶，同時也是C4植物和CAM植物固定CO₂的關鍵酶，對三羧酸循環(huán)的運轉(zhuǎn)起重要調(diào)節(jié)作用。

PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO₂生成草酰乙酸和HPO₄^2-，蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD⁺，在340nm測定NADH減少速率，計算PEPC活性。

Phosphoenolpyruvate + CO₂                                   Oxalylacetic Acid + HPO₄^2-

Oxalylacetic Acid + NADH                        Malic acid + NAD⁺

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者

增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后，8000g，4℃，離心20min。

2、細菌或細胞：按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心20min，取上清置于冰上待測。

3、血清（漿）等液體：直接檢測。若有渾濁則離心后取上清測定。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2、 根據(jù)樣本量取部分試劑一和工作液置于30℃平衡10min。

3、 操作表（在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入下列試劑）：

在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入上述試劑，充分混勻后于340nm處測定10s時的吸光值A1，迅速置于30℃水浴或培養(yǎng)箱5min（酶標儀有控溫功能的可將溫度調(diào)至30℃），拿出迅速擦干測定310s時的吸光值A2，計算ΔA測定管=A1測定-A2測定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管。（空白管只需做1-2次）

三、PEPC酶活計算

1、 按微量石英比色皿計算：

（1）按蛋白濃度計算

酶活定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=321×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每g組織在反應體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T =321×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞數(shù)量計算

酶活定義：每10⁴個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣÷V樣總×N）÷T=321×ΔA÷N

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/ mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，2×10^-4L；V樣：反應體系中樣本體積，0.02mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入提取液體

積，1mL；T：反應時間：5min；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol；N：細胞數(shù)量，以萬計。

2、 按96孔UV板計算：

將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔板光徑）進行計算即可。

注意事項：

1、 為保證實驗結(jié)果的準確性，需先取1-2個樣做預實驗，ΔA大于0.6時，建議將粗酶液用提取液稀釋后再進行測定。當ΔA小于0.01時，可以延長反應時間（10min或15min）來測定。

2、 空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔，正常情況下，變化不超過0.02。

實驗實例：

1、 取0.1g天竺葵葉片加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定=A1測定-A2測定=1.013-0.9753=0.0377，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.8407-0.8392=0.0015，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.0377-0.0015=0.0362，按樣本質(zhì)量計算酶活：

PEPC酶活（U/g質(zhì)量）=321×ΔA÷W=321×0.0362÷0.1=116.202 U/g 質(zhì)量。

2、 取0.1g蘆薈葉片加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定=A1測定-A2測定=0.7049-0.6699=0.035，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.8407-0.8392=0.0015，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.035-0.0015=0.0335，按樣本質(zhì)量計算酶活：

PEPC酶活（U/g質(zhì)量）=321×ΔA÷W=321×0.0355÷0.1=107.535 U/g 質(zhì)量。

參考文獻：

[1] Zhang Y H, Wang Z M, Huang Q, et al. Phosphoenolpyruvate carboxylase activity in ear organs is related to protein concentration in grains of winter wheat[J]. Journal of cereal science, 2008, 47(2): 386-391.

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