羊外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒
貨號：P5290
規(guī)格：2×200ml/KIT
保存 ：室溫避光儲存，有效期少 2 年。

羊外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒

規(guī)格：4×200 ml/kit
保存：本產(chǎn)品對光敏感，應(yīng)該室溫避光儲存，保質(zhì)期 2 年。無菌開封后，保存于室溫。 組成：
試劑A 200mL
試劑D 200mL
全血及組織稀釋液 200mL
細(xì)胞洗滌液 200mL

操作步驟：
1. 取新鮮抗凝全血（EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝血均可）或者去纖維蛋白血液，用等體積的全血及組織稀釋液或者PBS稀釋全血。
2. 取一支無菌離心管，先加入試劑A，再加入試劑D，使兩者形成梯度界面（試劑A：試劑D的體積比為3：2，如稀釋后的血液樣本小于5ml，則先后加入3ml試劑A和2ml試劑D；如稀釋后的血液樣本大于5ml，試劑總量與稀釋后的血液樣本量相等），兩種試劑的分層一定要清晰。
3. 將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方，注意保持兩液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后將血液小心的平鋪于分離液上，因為兩者的密度差異，將形成明顯的分層界面。如果樣品較多，加樣的時間較長，在離心之前出現(xiàn)紅細(xì)胞成團(tuán)下沉屬正?，F(xiàn)象）
4. 室溫，水平轉(zhuǎn)子500~800g，離心20~30min（血液的體積越大所需的離心力越大，離心時間越長，分離條件需自行摸索，離心轉(zhuǎn)速大不超過1000g）。
5. 離心后將出現(xiàn)明顯的分層： 層為血漿層；第二層為白色單核細(xì)胞層；第三層為透明試劑D液層；第四層為半透明試劑A液層；第五層為紅細(xì)胞層（如圖示）。
6. 小心吸取第二層試劑D層和第三層乳白色細(xì)胞層到另一無菌的15ml離心管中，加入10mL細(xì)胞洗滌液或PBS，顛倒混勻，250g，離心10min。
7. 棄上清，5mL的細(xì)胞清洗液或PBS重懸細(xì)胞，250g，離心10min。
8. 重復(fù)步驟7
9. 棄上清，細(xì)胞重懸備用。
10. 差異貼壁法純化細(xì)胞：用單核細(xì)胞培養(yǎng)基以10
6個/ml的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
1) 2~4 h內(nèi)貼壁的為單核細(xì)胞。
2) 10~24 h內(nèi)貼壁的單個核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞 。
3) 不貼壁的為淋巴細(xì)胞。
根據(jù)不同細(xì)胞的貼壁時間存在差異，以達(dá)到簡單純化單核細(xì)胞的目的。此法成本低，操作簡便。如需獲得高純度的目的細(xì)胞則需選用免疫磁珠分選或者是應(yīng)用流式技術(shù)分選細(xì)胞。
血漿層
單核細(xì)胞層
試劑 D
試劑 A
紅細(xì)胞層
分層示意圖

注意事項：
A. 開封前顛倒混勻，本分離液為無菌產(chǎn)品，為延長分離液保存時間，請在無菌條件下啟封，避免微生物污染。。
B. 分離液使用時應(yīng)始終保持室溫（18℃~25℃），如室內(nèi)溫度較低，可將分離液預(yù)熱。4℃或者是溫度較低的條件下離心，可能會導(dǎo)致白膜層中紅細(xì)胞污染加重。
C. 血液樣本為新鮮的抗凝血（采血2 h以內(nèi)），為保持單核細(xì)胞的活性，應(yīng)避免冷凍和冷藏。
D. 稀釋血液或洗滌細(xì)胞，不可使用含Ca、Mg離子的緩沖液及培養(yǎng)液，其成分會導(dǎo)致血細(xì)胞凝集，大大降低細(xì)胞得率及純度。
E. 部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其帶有的靜電作用，可能會導(dǎo)致細(xì)胞掛壁，影響分離效果。
F. 血液樣本的粘稠度或者是溫度差異，可能會影響分離效果，可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心時間，摸索分離條件。
G. 吸取過多的單核細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加；吸取過多的血漿層可能會導(dǎo)致單核細(xì)胞中血漿蛋白及血小板污染。
H. 如果要進(jìn)一步對分離的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，那在收集血液和分離過程中，注意無菌操作，避免微生物污染。
I. 不同動物血液在不同比重分離液中的細(xì)胞離散系數(shù)及細(xì)胞帶電不同，用戶在制定分離液時應(yīng)提供所需分離液的比重、動物種屬及被分離細(xì)胞的名稱。 參考文獻(xiàn)
相關(guān)產(chǎn)品：
R1018 細(xì)胞洗滌液
S9020 優(yōu)級胎牛血清
R1017 全血及組織稀釋液
31800 RPMI Medium 1640
T1300 胰蛋白酶－EDTA消化液(0.25%)不含酚紅
YA0902 一次性巴氏德吸管
各種其他動物及其他細(xì)胞的分離液及試劑盒

 參考文獻(xiàn)：
《Responses of Transgenic Melatonin-Enriched Goats on LPS Stimulation and the Proteogenomic Profiles of Their PBMCs》 作者:Minghui Yang , Jingli Tao , Hao Wu , Lu Zhang, Yujun Yao , Lixi Liu , Tianqi Zhu , Hao Fan , Xudai Cui , Haoran Dou  and Guoshi Liu 期刊:International Journal of Molecular Sciences 影響因子:4.183 PMID:30111707