線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ/ATP合酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書操作。
貨號(hào)：BC1445
規(guī)格：100T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前每支加入1.11 mL雙蒸水，充分溶解備用，分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

2. 試劑五：臨用前加入10mL雙蒸水，充分溶解；-20℃可保存4周；

3. 試劑六：臨用前加入10mL雙蒸水，充分溶解；2-8℃可保存4周；

4. 標(biāo)準(zhǔn)品：10 μmol/mL磷標(biāo)液，臨用前取50μL 10 μmol/mL磷標(biāo)液，加入1950μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液使用，現(xiàn)用現(xiàn)配（實(shí)驗(yàn)中每管需要40μL，為減小實(shí)驗(yàn)誤差，故配制大體積）；

5. 定磷試劑的配制：根據(jù)用量將H₂O：試劑五：試劑六：試劑七=20mL:10mL:10mL:10mL（約100T）混合備用，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染（請(qǐng)根據(jù)需要，用多少配多少）。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻璃棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
產(chǎn)品說(shuō)明：
線粒體復(fù)合體Ⅴ又稱F₁F₀-ATP合酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，由F₁和F₀兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成，也可逆過(guò)程水解ATP。此外，復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌中。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。
復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi，通過(guò)測(cè)定Pi增加速率來(lái)測(cè)定復(fù)合體Ⅴ活性。
   
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
臺(tái)式離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見(jiàn)“產(chǎn)品資料"附件
注意事項(xiàng)：

1. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果測(cè)定的吸光值過(guò)高（高于1），可用蒸餾水稀釋上清液后再測(cè)定。計(jì)算結(jié)果時(shí)注意乘以稀釋倍數(shù)。

2. 測(cè)定胞漿時(shí)，定磷后反應(yīng)液可能會(huì)有絮凝產(chǎn)生，測(cè)定前混合均勻即可，并不影響測(cè)定結(jié)果。

3. 推薦使用樣本蛋白濃度計(jì)算酶活，若用樣本質(zhì)量計(jì)算，則需加測(cè)胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。

4. 本試劑盒試劑足夠完成100管反應(yīng)。

5. 附:使用樣本重量計(jì)算公式：（樣本檢測(cè)數(shù)為100T/24S）

1. 上清中復(fù)合體Ⅴ活力的計(jì)算：

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)×V酶促×1000÷(W÷V提取×V樣本)）÷T
=20×ΔA1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W
ΔA1：上清測(cè)定值；C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，0.25μmol/mL；1000：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1μmol=1000nmol；V提取：加入提取液體積，1.0mL；V樣本：樣本體積，0.05mL；V酶促：酶促反應(yīng)總體積，0.12mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。
B、沉淀中復(fù)合體Ⅴ活力的計(jì)算：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)×V酶促×1000÷(W÷V提取×V樣本)）÷T
=12×ΔA2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W
ΔA2：沉淀測(cè)定值；C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，0.25μmol/mL；1000：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1μmol=1000nmol；V提?。撼恋碇貞殷w積，0.6mL；V樣本：樣本體積，0.05mL；V酶促：酶促反應(yīng)總體積，0.12mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。
C、樣本復(fù)合體Ⅴ總活力的計(jì)算：
樣本復(fù)合體Ⅴ總活力即為上清中復(fù)合體Ⅴ活力與沉淀中復(fù)合體Ⅴ活力之和。
按樣本質(zhì)量計(jì)算：復(fù)合體Ⅴ（U/g 質(zhì)量）=20×ΔA1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W+12×ΔA2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g兔子腎臟進(jìn)行樣本處理，上清液和沉淀都稀釋4倍后按照測(cè)定步驟操作，使用96孔板測(cè)得ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.379-0.047=0.332，上清液的ΔA1=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.679-0.119=0.560，沉淀的ΔA2=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.773-0.052=0.721，則按樣本質(zhì)量計(jì)算得：上清中復(fù)合體Ⅴ活性（U/g 質(zhì)量）=20×ΔA1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×4（稀釋倍數(shù)）=1349.4 U/g 質(zhì)量沉淀中復(fù)合體Ⅴ活性（U/g 質(zhì)量）=12×ΔA2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×4（稀釋倍數(shù)）=1042.4 U/g 質(zhì)量復(fù)合體Ⅴ（U/g 質(zhì)量）=20×ΔA1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×4+12×ΔA2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×4=2391.8 U/g 質(zhì)量。

2. 取0.1g冬青進(jìn)行樣本處理，上清液和沉淀都稀釋2倍后按照測(cè)定步驟操作，使用96孔板測(cè)得ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.379-0.047=0.332，上清液的ΔA1= A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.535-0.320=0.215，沉淀的ΔA2=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.357-0.089=0.268，則按樣本質(zhì)量計(jì)算得：上清中復(fù)合體Ⅴ活性（U/g 質(zhì)量）=20×ΔA1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×2（稀釋倍數(shù)）=259.04 U/g 質(zhì)量 沉淀中復(fù)合體Ⅴ活性（U/g 質(zhì)量）=12×ΔA2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×2（稀釋倍數(shù)）=193.73 U/g 質(zhì)量復(fù)合體Ⅴ（U/g 質(zhì)量）=20×ΔA1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×2+12×ΔA2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×2=452.77 U/g 質(zhì)量。

相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

1. Qiuli OuYang,Nengguo Tao,Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. Frontier in Immunology. February 2018;(IF4.259)  

2. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J].Free Radical Biology and Medicine,2019,134:229-238.

相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC0510/BC0515 線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ活性檢測(cè)試劑盒
BC3230/BC3235 線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ活性檢測(cè)試劑盒
BC3240/BC3245 線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ活性檢測(cè)試劑盒
BC0940/BC0945 線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活性檢測(cè)試劑盒
 

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