FITC熒光標(biāo)記抗體是目前較為常用的標(biāo)記抗體的方法，F(xiàn)ITC一般呈黃色、褐色或褐黃色粉末或結(jié)晶，性質(zhì)穩(wěn)定在低溫中能保存數(shù)年。在堿性條件下，F(xiàn)ITC的碳酰胺鍵可與抗體蛋白上的賴氨酸氨基共價結(jié)合，形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物，即熒光抗體或熒光結(jié)合物。
一個抗體分子上能標(biāo)記15~20個FITC分子，被標(biāo)記的抗體仍能保持與相應(yīng)抗原結(jié)合的能力，在熒光燈源紫外線或藍(lán)紫光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光，通過熒光顯微鏡進行觀察或利用流式細(xì)胞儀分析，從而對抗原進行定性、定位或定量。下面就跟隨小編一起來了解其操作步驟吧！
FITC熒光標(biāo)記抗體的操作步驟：
1、用碳酸氫鈉緩沖液pH9.8稀釋抗體為1-5mg/m1，或抗體對該緩沖液充分透析，以足以使賴氨酸不解離(去其正電荷)，但注意保持大部分蛋白質(zhì)仍未變性；
2、將透析袋放入100m1含0.1mg/MIfitc的pH9.8碳酸氫鈉緩沖液(新配制)的燒杯中，用鋁鉑包燒杯以避光，4℃攪拌過夜；
3、上述抗體液對PBS在4℃透析以終止反應(yīng)。其間至少更換PBS液三次，直致480nm的吸收為零；
4、加入0.5g/L的疊氮鈉。此后，結(jié)合物在4℃避光保存，或分裝后在-20℃凍存。
FITC熒光標(biāo)記抗體注意事項：
1、偶聯(lián)反應(yīng)要求在盡可能接近pH9.8的溶液中進行，而且注意在反應(yīng)過程中要保持此pH水平；
2、要確定在偶聯(lián)反應(yīng)緩沖液中不含游離氨基(Tris，氨及疊氮鈉均可與FITC反應(yīng)，因此會降低蛋白質(zhì)與FITC的偶聯(lián)率)；
3、FITC與蛋白質(zhì)的比值(F/P)，可通過測定495m與280nm吸光度來鑒定。此比值的范圍應(yīng)為0.3-1.0。
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