蛋白質(zhì)印跡（Western Blot，WB）又稱為免疫印跡（Immunoblot），其是利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將樣品中分子量大小不同的蛋白分開(kāi)，然后通過(guò)電轉(zhuǎn)移的方法將凝膠中的蛋白幾乎原位、定量地遷移、固定到固相膜上，再利用抗原、抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)以及特殊的抗體標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)而對(duì)目的蛋白進(jìn)行定性、相對(duì)定量檢測(cè)的技術(shù)。

常見(jiàn)問(wèn)題

蛋白提取后可以存放多久？

A：

蛋白提取后-80℃可保存一年。建議分裝保存，避免反復(fù)凍融。

蛋白提取時(shí)用進(jìn)行超聲破碎嗎？

A：

一般建議進(jìn)行超聲處理，這樣可使樣本裂解更充分，對(duì)于核蛋白、核染色質(zhì)相關(guān)蛋白等難提取、復(fù)雜的蛋白，超聲處理是關(guān)鍵因素。

做組織樣品蛋白的WB的時(shí)候，提取蛋白

有什么特別注意的嗎？

A：

必須進(jìn)行研磨、勻漿處理，做超聲處理，使蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分。組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要加入抑制蛋白酶活性的抑制劑，防止蛋白降解。

蛋白含量測(cè)定方法的選擇？

A：

提取的樣品中若含有去垢劑則需要選用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，若樣品中含有螯合劑(EDTA，EGTA)、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類等，則需要選用Bradford法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。

WB實(shí)驗(yàn)中樣品上樣量是多少？

A：

細(xì)胞裂解物或組織勻漿的總蛋白的上樣量一般為20-40μg，純化蛋白的上樣量一般為10-100ng。

WB實(shí)驗(yàn)中一般需要多少個(gè)細(xì)胞？

A：

一般5×10⁶足夠。但要看是哪種細(xì)胞，有的細(xì)胞的體積就很小，而有的細(xì)胞則鋪得很開(kāi)。常規(guī)做WB一個(gè)孔道上樣要10⁵個(gè)細(xì)胞。但也和目的蛋白及提取的方式有關(guān)。如果是膜蛋白或是某細(xì)胞器內(nèi)分布的蛋白細(xì)胞數(shù)得增多。

電泳后為什么會(huì)出現(xiàn)“微笑”或

“倒微笑”條帶？

A：

a)“微笑”是因?yàn)楣嗄z的時(shí)候冷卻不均勻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致凝膠中的分子有不同的遷移率所致。

b)“倒微笑”現(xiàn)象常常是由于垂直電泳時(shí)電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的三明治底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不*，加APS和TEMED后應(yīng)該混合均勻。

c)電泳和轉(zhuǎn)膜溫度過(guò)高，點(diǎn)樣量太多或每孔點(diǎn)樣量不均勻，電泳電壓不穩(wěn)定或過(guò)高都可能引起條帶不整齊的現(xiàn)象。

轉(zhuǎn)膜注意事項(xiàng)？

A：

a)濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙≥膜≥膠。

b)濾紙、膠、膜之間千萬(wàn)不能有氣泡，氣泡會(huì)造成短路。

c)保持膜的濕潤(rùn)，若FVDF膜干燥，需要重新用甲醇活化。

脫脂奶粉和 BSA 封閉有區(qū)別嗎？

A：

一般來(lái)講，BSA 會(huì)產(chǎn)生更清晰的結(jié)果，因?yàn)?BSA 含有較少的蛋白，抗體與之發(fā)生交叉反應(yīng)的概率較低。但并非總是如此，有些抗體在脫脂奶粉中的封閉效果更好，因?yàn)槊撝谭壑泻懈喾N類的封閉蛋白，能封閉更多不同類型的蛋白質(zhì)。

一抗二抗用什么稀釋？

A：

一抗可用封閉液稀釋。二抗可用TBST稀釋，若感覺(jué)背景高也可以用封閉液進(jìn)行稀釋。若使用商品化的WB抗體稀釋液，則需要注意稀釋液中是否還有防腐劑（NaN₃），若含有則不能稀釋HRP標(biāo)記二抗。

目的蛋白分子量為何與實(shí)際不符？

A：

a)翻譯后修飾：蛋白發(fā)生如磷酸化、糖基化等翻譯后修飾時(shí)分子量會(huì)增加；

b)翻譯后剪切：蛋白發(fā)生剪切時(shí)分子量會(huì)降低，某些蛋白在合成時(shí)是作為前提蛋白合成的，然后剪切形成活性形式；

c)剪切異構(gòu)體：同一基因經(jīng)不同剪切方式可能產(chǎn)生不同大小的蛋白；

d)多聚體：比如蛋白二聚化；

e)電泳，膠濃度，蛋白Marker等因素也會(huì)影響實(shí)際蛋白分子量的判斷。

內(nèi)參抗體的選擇？

A：